免疫熒光（IF）是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項檢測技術。可用于檢測和識別細胞和組織中蛋白質及其他分子的亞細胞分布和遷移。那么你知道免疫熒光實驗的注意事項有什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、設置對照

可以使用陽性和陰性對照來確定結果的準確性，并幫助確定任何問題的來源。

二、樣品和試劑的存儲

由于IF中所用抗體和實驗樣品的熒光性質，因此必須適當存儲。最好將熒光抗體和經過IF處理的樣品都保存在wan全黑暗的環(huán)境中。使用琥珀色或鋁箔覆蓋抗體管。

三、使用適當的固定劑

醛可用于標記膜結合抗原或細胞骨架抗原，并應用于核蛋白或線粒體蛋白。醛固定后的樣本需要抗原修復和打孔滲透步驟才能正確檢測抗原。如果使用單克隆抗體推薦有機溶劑用于組織固定。甲醇適用于冷凍樣本的固定；丙酮固定對組織學保存效

四、仔細選擇抗體

應檢查所有抗體，無論是單克隆抗體還是多克隆抗體，以確保與目標抗原具有高的親和力。所用的二抗必須與一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗檢測小鼠來源的一抗。

五、多色染色

最好使用在不同物種中產生的一抗。如果使用間接檢測，請使用已預先吸附在檢測其他蛋白質的一抗和二抗的種屬以及實驗樣品的物種中的二抗。這樣可以zui大程度地減少跨物種的反應性和非特異性結合。所有二抗也應在同一物種中產生，以zui大程度地減少交叉反應。

六、決定直接或間接染色

兩種方法都有優(yōu)點和缺點，根據實驗需求選擇。使用這兩種方法，都應該確保充足的洗滌以最小化非特異性的結合。

七、選擇沒有光譜重疊的熒光團

IF是一種很好的多路復用分析技術，測量如此多的參數，那么使用能夠提供可分辨信號的熒光團是很有必要的。

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